Los utilisomas de la membrana externa median la absorción de glicanos en el intestino Bacteroidetes

Naturaleza (2023)Citar este artículo

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Los bacteroidetes son miembros abundantes de la microbiota humana y utilizan una miríada de glicanos derivados de la dieta y del huésped en el intestino distal1. La captación de glicanos a través de la membrana externa bacteriana de estas bacterias está mediada por complejos de proteína SusCD, que comprenden un barril incrustado en la membrana y una tapa de lipoproteína, que se cree que se abre y se cierra para facilitar la unión y el transporte del sustrato. Sin embargo, las proteínas de unión a glucanos expuestas en la superficie y las hidrolasas de glucósidos también desempeñan un papel fundamental en la captura, el procesamiento y el transporte de cadenas de glucanos grandes. Las interacciones entre estos componentes en la membrana externa son poco conocidas, a pesar de que son cruciales para la adquisición de nutrientes por parte de nuestra microbiota colónica. Aquí mostramos que tanto para los sistemas de utilización de leván como de dextrano de Bacteroides thetaiotaomicron, los componentes adicionales de la membrana externa se ensamblan en el transportador central SusCD, formando máquinas estables que utilizan glicanos que denominamos utilisomas. Las estructuras de microscopía electrónica criogénica de una sola partícula en ausencia y presencia de sustrato revelan cambios conformacionales concertados que demuestran el mecanismo de captura del sustrato y racionalizan el papel de cada componente en el utilisoma.

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Los datos que respaldan los hallazgos de este estudio están disponibles de los autores correspondientes previa solicitud razonable. Las reconstrucciones crio-EM y las coordenadas correspondientes se han depositado en el Banco de datos de microscopía electrónica y el PDB, respectivamente: utilisoma de leván libre de sustrato (EMD-15288 y PDB 8A9Y), utilisoma de leván con FOS DP 8–12 (EMD-15289 y PDB 8AA0), núcleo SusC2D2 del utilisoma de levan con FOS DP 8–12 (EMD-15290 y PDB 8AA1), utilisoma de levan inactivo con FOS DP 15–25 (EMD-15291 y PDB 8AA2), núcleo SusC2D2 del utilisoma de levan inactivo con FOS DP 15–25 (EMD-1592 y PDB 8AA3), refinamiento de consenso de utilisoma de dextrano (EMD-15293 y PDB 8AA4). Las coordenadas y los factores de estructura de los experimentos de cristalografía de rayos X para GHlev se han depositado en el PDB con los códigos de acceso 7ZNR y 7ZNS. Los datos de proteómica de espectrometría de masas se han depositado en ProteomeXchange Consortium a través del repositorio de socios PRIDE con el identificador de conjunto de datos PXD034863. Los datos sin procesar de este estudio están disponibles en el repositorio de datos de la Universidad de Leeds: https://doi.org/10.5518/1329. Los datos de origen se proporcionan con este documento.

Koropatkin, NM, Cameron, EA y Martens, EC Cómo el metabolismo de los glicanos da forma a la microbiota intestinal humana. Nat. Rev. Microbiol. 10, 323–335 (2012).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Fan, Y. & Pedersen, O. Microbiota intestinal en la salud y la enfermedad metabólica humana. Nat. Rev. Microbiol. 19, 55–71 (2021).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Hamaker, BR & Tuncil, YE Una perspectiva sobre la complejidad de las estructuras de fibra dietética y su efecto potencial en la microbiota intestinal. J. Mol. Biol. 426, 3838–3850 (2014).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Morrison, DJ & Preston, T. Formación de ácidos grasos de cadena corta por la microbiota intestinal y su impacto en el metabolismo humano. Microbios intestinales 7, 189–200 (2016).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Koh, A., De Vadder, F., Kovatcheva-Datchary, P. & Bäckhed, F. De la fibra dietética a la fisiología del huésped: ácidos grasos de cadena corta como metabolitos bacterianos clave. Celda 165, 1332–1345 (2016).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Huttenhower, C. et al. Estructura, función y diversidad del microbioma humano sano. Naturaleza 486, 207–214 (2012).

Artículo ADS CAS Google Académico

Nikaido, H. Revisión de la base molecular de la permeabilidad de la membrana externa bacteriana. Microbiol. mol. Biol. Rev. 67, 593–656 (2003).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Martens, EC, Koropatkin, NM, Smith, TJ & Gordon, JI Catabolismo de glicanos complejos por la microbiota intestinal humana: el paradigma Bacteroidetes Sus-like. J. Biol. química 284, 24673–24677 (2009).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Bolam, DN & van den Berg, B. Transporte dependiente de TonB por la microbiota intestinal: aspectos novedosos de un viejo problema. actual Opinión Estructura. Biol. 51, 35–43 (2018).

Glenwright, AJ y col. Base estructural para la adquisición de nutrientes por miembros dominantes de la microbiota intestinal humana. Naturaleza 541, 407–411 (2017).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Madej, M. et al. Información estructural y funcional sobre la adquisición de oligopéptidos por el transportador RagAB de Porphyromonas gingivalis. Nat. Microbiol. 5, 1016–1025 (2020).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Gray, DA et al. Información sobre la importación de glicanos mediada por SusCD por un simbionte intestinal prominente. Nat. común 12, 44 (2021).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Terrapon, N. et al. PULDB: la base de datos ampliada de loci de utilización de polisacáridos. Ácidos Nucleicos Res. 46, D677–D683 (2018).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Sonnenburg, ED et al. La especificidad del uso de polisacáridos en especies de bacteroides intestinales determina las alteraciones de la microbiota inducidas por la dieta. Celda 141, 1241–1252 (2010).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Öner, ET, Hernández, L. & Combie, J. Revisión del polisacárido Levan: de un siglo de experiencias pasadas a perspectivas futuras. Biotecnología. Adv. 34, 827–844 (2016).

Mardo, K. et al. Una endo-levanasa BT1760 altamente activa de un comensal intestinal dominante de mamíferos Bacteroides thetaiotaomicron escinde no solo varios levanos bacterianos, sino también levanos de pasto fleo. PLoS ONE 12, e0169989 (2017).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Bolam, DN & Sonnenburg, JL Visión mecanicista del uso de polisacáridos dentro de la microbiota intestinal. Microbios intestinales 2, 86–90 (2011).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Reeves, AR, Wang, GR y Salyers, AA Caracterización de cuatro proteínas de la membrana externa que desempeñan un papel en la utilización del almidón por Bacteroides thetaiotaomicron. J. Bacteriol. 179, 643–649 (1997).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Cho, KH & Salyers, AA Análisis bioquímico de las interacciones entre las proteínas de la membrana externa que contribuyen a la utilización del almidón por Bacteroides thetaiotaomicron. J. Bacteriol. 183, 7224–7230 (2001).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Karunatilaka, KS, Cameron, EA, Martens, EC, Koropatkin, NM y Biteen, JS Las imágenes de superresolución capturan la dinámica de utilización de carbohidratos en simbiontes intestinales humanos. mBio 5, e02172 (2014).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Tuson, HH, Foley, MH, Koropatkin, NM & Biteen, JS El sistema de utilización de almidón se ensambla alrededor de proteínas fijas de almidón estacionarias. Biografía. J. 115, 242–250 (2018).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Schwanhüsser, B. et al. Cuantificación global del control de la expresión génica en mamíferos. Naturaleza 473, 337–342 (2011).

Artículo ANUNCIOS Google Académico

Jumper, J. et al. Predicción de estructura de proteínas de alta precisión con AlphaFold. Naturaleza 596, 583–589 (2021).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Tamura, K. & Brumer, H. Sistemas de utilización de glicanos en la microbiota intestinal humana: una mina de oro para descubrimientos estructurales. actual Opinión Estructura. Biol. 68, 26–40 (2020).

Artículo PubMed Google Académico

Nilaweera, TD, Nyenhuis, DA & Cafiso, DS Los intermedios estructurales observados solo en Escherichia coli intacta indican un mecanismo para el transporte dependiente de TonB. eLife 10, e68548 (2021).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zmyslowski, AM, Baxa, MC, Gagnon, IA y Sosnick, TR HDX-MS realizado en BtuB en membranas externas de E. coli delinea la alostería del dominio luminal y se despliega tras la unión de B12 y TonB. proc. Academia Nacional. ciencia EE.UU. 119, e2119436119 (2022).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Cuyvers, S., Dornez, E., Delcour, JA y Courtin, CM Ocurrencia y significado funcional de los sitios de unión de carbohidratos secundarios en las glucósidos hidrolasas. crítico Rev. Biotecnología. 32, 93–107 (2011).

Artículo PubMed Google Académico

Ernits , K. , Eek , P. , Lukk , T. , Visnapuu , T. & Alamäe , T. Primera estructura cristalina de una endo-levanasa: la BT1760 de un comensal del intestino humano Bacteroides thetaiotaomicron . ciencia Reps. Rev. 9, 8443 (2019).

Artículo ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Tamura, K. et al. Las proteínas de unión a glicanos de superficie son esenciales para la utilización de beta-glucanos de cereales por parte del simbionte intestinal humano Bacteroides ovatus. Celúla. mol. Ciencias de la vida 76, 4319–4340 (2019).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Tamura, K., Dejean, G., Van Petegem, F. & Brumer, H. Distintas arquitecturas de proteínas median la unión y el metabolismo de beta-glucanos específicos de especie en la microbiota intestinal humana. J. Biol. química 296, 100415 (2021).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Grondin, JM, Tamura, K., Déjean, G., Abbott, DW y Brumer, H. Loci de utilización de polisacáridos: combustible para comunidades microbianas. J. Bacteriol. 199, e00860-16 (2017).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

McKee, LS y col. Degradación de polisacáridos por Bacteroidetes: mecanismos y nomenclatura. Reinar. Microbiol. Rep. 13, 559–581 (2021).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Rassam, P. et al. Los ensamblajes supramoleculares sustentan la renovación de las proteínas de la membrana externa en las bacterias. Naturaleza 523, 333–336 (2015).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Benn, G. et al. Separación de fases en la membrana externa de Escherichia coli. proc. Academia Nacional. ciencia EE. UU. 118, e2112237118 (2021).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Briliūtė, J. et al. La degradación compleja de N-glicanos por Bacteroides intestinales implica un extenso aparato enzimático codificado por múltiples loci genéticos co-regulados. Nat. Microbiol. 4, 1571-1581 (2019).

Artículo PubMed Google Académico

Martens, EC et al. Reconocimiento y degradación de polisacáridos de la pared celular vegetal por dos simbiontes intestinales humanos. PLoS Biol. 9, e1001221 (2011).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ndeh, D. et al. El complejo metabolismo de la pectina por parte de las bacterias intestinales revela nuevas funciones catalíticas. Naturaleza 544, 65–70 (2017).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ritchie, ME y col. limma potencia los análisis de expresión diferencial para la secuenciación de ARN y los estudios de micromatrices. Ácidos Nucleicos Res. 43, e47 (2015).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Ramlaul, K., Palmer, CM y Aylett, CHS Un algoritmo de filtrado de acuerdo local para reconstrucciones EM de transmisión. J. Estructura. Biol. 205, 30–40 (2019).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Koropatkin, NM, Martens, EC, Gordon, JI & Smith, TJ El catabolismo del almidón por parte de un prominente simbionte del intestino humano está dirigido por el reconocimiento de hélices de amilosa. Estructura 16, 1105-1115 (2008).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zougman, A., Selby, PJ & Banks, RE Método de preparación de muestras con atrapamiento en suspensión (STrap) para análisis de proteómica de abajo hacia arriba. Proteómica 14, 1006-1000 (2014).

Artículo PubMed Google Académico

Haile Mariam, M. et al. S-Trap, un enfoque ultrarrápido de preparación de muestras para proteómica de escopeta. J. Proteoma Res. 17, 2917–2924 (2018).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Cox, J. & Mann, M. MaxQuant permite altas tasas de identificación de péptidos, precisiones de masa de rango de ppb individualizadas y cuantificación de proteínas de todo el proteoma. Nat. Biotecnología. 26, 1367-1372 (2008).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Cox, J. et al. Andromeda: un motor de búsqueda de péptidos integrado en el entorno MaxQuant. J. Proteoma Res. 10, 1794–1805 (2011).

Artículo ADS CAS PubMed Google Scholar

Invierno, G. et al. DIALS: implementación y evaluación de un nuevo paquete de integración. Acta Crystallogr. D 74, 85–97 (2018).

Artículo CAS Google Académico

Winter, G. Xia2: un sistema experto para la reducción de datos de cristalografía macromolecular. Aplicación J. cristalogr. 43, 186–190 (2010).

Artículo CAS Google Académico

Evans, PR & Murshudov, GN ¿Qué tan buenos son mis datos y cuál es la resolución? Acta Crystallogr. D 69, 1204–1214 (2013).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Evans, P. Escalamiento y evaluación de la calidad de los datos. Acta Crystallogr. D 62, 72–82 (2006).

Skubak, P. et al. Un nuevo algoritmo MR-SAD para la construcción automática de modelos de proteínas a partir de datos de rayos X de baja resolución y un modelo de partida pobre. En t. Unión de Crystallogr. J. 5, 166–171 (2018).

Kabsch, W. XDS. Acta Crystallogr. D 66, 125-132 (2010).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Krissinel, E., Uski, V., Lebedev, A., Winn, M. y Ballard, C. Computación distribuida para cristalografía macromolecular. Acta Crystallogr. D 74, 143–151 (2018).

Artículo CAS Google Académico

Vagin, AA et al. Diccionario REFMAC5: organización de conocimientos químicos previos y pautas para su uso. Acta Crystallogr. D 60, 2184–2195 (2004).

Artículo PubMed Google Académico

Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, WG y Cowtan, K. Características y desarrollo de Focha. Acta Crystallogr. D 66, 486–501 (2010).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Winn, MD y col. Descripción general de la suite CCP4 y desarrollos actuales. Acta Crystallogr. D 67, 235–242 (2011).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Liebschner, D. et al. Determinación de la estructura macromolecular mediante rayos X, neutrones y electrones: desarrollos recientes en Phenix. Acta Crystallogr. D 75, 861–877 (2019).

Artículo CAS Google Académico

Zivanov, J. et al. Nuevas herramientas para la determinación automatizada de estructuras crio-EM de alta resolución en RELION-3. eLife 7, e42166 (2018).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Zheng, SQ et al. MotionCor2: corrección anisotrópica del movimiento inducido por haz para mejorar la microscopía crioelectrónica. Nat. Métodos 14, 331–332 (2017).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zhang, K. Gctf: determinación y corrección de CTF en tiempo real. J. Estructura. Biol. 193, 1–12 (2016).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Wagner, T. et al. SPHIRE-crYOLO es un selector de partículas totalmente automatizado rápido y preciso para crio-EM. común Biol. 2, 218 (2019).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Pettersen, EF et al. UCSF Chimera: un sistema de visualización para investigación y análisis exploratorios. J. Cómputo. química 25, 1605–1612 (2004).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Rohou, A. & Grigorieff, N. CTFFIND4: estimación de desenfoque rápida y precisa a partir de micrografías electrónicas. J. Estructura. Biol. 192, 216–221 (2015).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Hoh, SW, Burnley, T. & Cowtan, K. Enfoques actuales para la construcción de modelos automatizados en mapas crio-EM usando Buccaneer con CCP-EM. Acta Crystallogr. D 76, 531–541 (2020).

Artículo CAS Google Académico

Burnley, T., Palmer, CM & Winn, M. Desarrollos recientes en el paquete de software CCP-EM. Acta Crystallogr. D 73, 469–477 (2017).

Artículo CAS Google Académico

Goddard, TD et al. UCSF ChimeraX: superando los desafíos modernos en visualización y análisis. Ciencia de las proteínas 27, 14–25 (2018).

Artículo CAS PubMed Google Académico

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JBRW recibió el apoyo de una beca de doctorado de 4 años de Wellcome Trust (215064/Z/18/Z). BvdB cuenta con el respaldo financiero de un premio Wellcome Trust Investigator (214222/Z/18/Z), el apoyo a AS y YZMF está respaldado por una beca de la Universidad de Newcastle. Reconocemos a Diamond Light Source (Didcot, Reino Unido) por el tiempo de haz (propuestas mx306, mx1221, mx13587 y mx18598), y agradecemos al personal de las líneas de luz I02, I03, I04 e I24 por su apoyo. Toda la crio-EM se llevó a cabo en el Laboratorio de Bioestructura de Astbury, que recibió el apoyo financiero de la Universidad de Leeds y Wellcome Trust (108466/Z/15/Z y 221524/Z/20/Z). Damos las gracias a R. Thompson, E. Hesketh y D. Maskell para el apoyo de microscopía electrónica. La espectrometría de masas de identificación de proteínas se llevó a cabo en la instalación de espectrometría de masas de la Universidad de Leeds. Agradecemos a J. Ault y R. George por realizar este análisis. Para fines de acceso abierto, los autores han aplicado una licencia pública de derechos de autor CC BY a cualquier versión manuscrita aceptada por el autor que surja de esta presentación.

Estos autores contribuyeron igualmente: Joshua BR White, Augustinas Silale

Centro Astbury de Biología Molecular Estructural, Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad de Leeds, Leeds, Reino Unido

Joshua BR White y Neil A. Ranson

Instituto de Biociencias, Facultad de Medicina, Universidad de Newcastle, Newcastle upon Tyne, Reino Unido

Augustinas Silale, Matthew Feasey, Tiaan Heunis, Yiling Zhu, Hong Zheng, Akshada Gajbhiye, Susan Firbank, Arnaud Baslé, Matthias Trost, David N. Bolam y Bert van den Berg

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JBRW llevó a cabo crio-EM y determinó estructuras de crio-EM, supervisado por proteínas purificadas NARAS, determinó estructuras cristalinas de rayos X y llevó a cabo ITC, supervisado por proteínas purificadas BvdBMF. YZ preparó muestras de MO para proteómica. TH y AG llevaron a cabo proteómica, supervisados por MTHZ Bt1760 purificado, supervisados por DNBSF recopilaron datos de cristalografía de rayos X para Bt1760. AB resolvió estructuras cristalinas Bt1760 y administró el Laboratorio de Biología Estructural de Newcastle. BvdB generó cepas de B. theta, proteínas purificadas y Bt1761 cristalizado. JBRW, AS, DNB, BvdB y NAR escribieron el manuscrito.

Correspondencia a Bert van den Berg o Neil A. Ranson.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature agradece a Mirjam Czjzek, Stephen Withers y a los demás revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

( a ) Organización del PUL de leván que muestra las posiciones relativas de los genes dentro del PUL, con las funciones indicadas. Los cuatro componentes PUL asociados con OM (SusClev, SusDlev, GHlev y SGBPlev) están resaltados en el cuadro gris. Se muestra una estructura de rayos X de GHlev (Bt1760; endo-levanasa GH32) (azul; PDB-ID: 7ZNR). El modelo pronosticado por AlphaFold2 para SGBPlev (Bt1761) se muestra (rosa) orientado de tal manera que el extremo N-terminal está en la parte inferior y el dominio de unión de leván (C-terminal) propuesto está en la parte superior. Tenga en cuenta que los extremos N de GHlev y SGBPlev estarán lipidados y asociados con la valva exterior de la OM. Se muestra la estructura crio-EM del complejo dimérico SusCDlev en su estado abierto-abierto (SusClev es verde, SusDlev es gris). ( b ) Organización del PUL de dextrano que muestra las posiciones de los genes dentro del locus con funciones etiquetadas. Los componentes PUL asociados con OM están enmarcados en gris. Los modelos predichos por AlphaFold2 para GHdex (Bt3087; GH66 endo-dextranasa), el supuesto SGBPdex (Bt3088) y el complejo SusCDdex, se muestran coloreados como para el levan PUL en (a). ( c ) SDS-PAGE de la muestra previamente estudiada de SusCDlev10 purificada con LDAO antes (asterisco) y después de hervir. La muestra hervida muestra dos bandas débiles además de las de SusClev y SusDlev, que posteriormente se identificaron como GHlev y SGBPlev mediante espectrometría de masas. ( d ) Un promedio de clase obtenido durante la clasificación 3D del complejo central levan SusC2D2. Los componentes SusC y SusD (verde y gris respectivamente) se acoplan a la densidad. Una gran región de densidad permanece sin asignar (naranja). ( e ) Vista aislada de la densidad previamente no asignada con la estructura cristalina de GHlev (dibujo azul) ajustada a la densidad EM (azul) como un cuerpo rígido. Por lo tanto, la densidad restante se atribuyó a SGBPlev y es de color magenta.

Datos fuente

( a ) Salida de la primera ronda de clasificación 3D para datos de utilidad apo. Las clases amarilla, violeta y rosa representan el complejo octámero, es decir, el utilisoma octámero completo. La clase verde muestra las lipoproteínas adicionales asociadas con una sola unidad SusC, mientras que la clase azul muestra que estaba presente una pequeña proporción del complejo central SusC2D2. ( b ) Salida de clasificación 3D para el utilisoma de leván con una levanasa activa en presencia de FOS DP8-12. Se observaron clases (vistas en el plano de la membrana) que contenían partículas del complejo octamérico completo (azul y verde), así como complejos hexámeros que contenían una única copia de SGBPlev y GHlev (rosa y amarillo). También está presente una clase que contiene SusCDlev de forma aislada (púrpura). ( c ) Salidas de clasificación 3D para FOS largo (DP15-25) que muestran que SGBPlev puede adoptar una conformación 'acoplada' próxima tanto a SusD como a levanasa. (d) Un refinamiento por consenso de todas las clases que contienen al menos un SGBP acoplado (amarillo, rosa, cian y verde en el panel (c)). Se creó una máscara alrededor de la región de interés (amarillo transparente). ( e ) Salidas de clasificación enfocada en la región enmascarada sin alineación. Una clase que muestra alta resolución para la región de interés está marcada con un asterisco rojo. Se reconstruyeron semimapas independientes utilizando partículas desenmascaradas pertenecientes a esta clase. (f) Reconstrucción mejorada generada con los medios mapas antes mencionados que muestran una densidad mejorada para SGBPlev.

( a ) Clasificación 3D del utilisoma de apo levan visto desde fuera de la célula. SusClev (verde), SusDlev (gris), SGBPlev (magenta) y GHlev (azul). Las clases se separan en sus posiciones de tapa SusDlev. Estados abiertos ancho (WW), normal-ancho (NW) y normal-normal (NN) (de izquierda a derecha) (b) Superposición de los estados abiertos ancho (SusD gris) y normal (SusD naranja) del complejo. ( c ) Superposición de modelos atómicos para el estado normal versus completamente abierto generado por un ajuste de cuerpo rígido de SusDlev en la densidad cryoEM. Se muestra un monómero para mayor claridad y un asterisco marca la misma hélice SusDlev en ambos modelos. ( d ) Una vista de los utilisomas que se muestran en el umbral alto en el plano de la membrana (izquierda). Se superponen diferentes conformaciones del SGBPlev observadas en la clasificación 3D para demostrar la flexibilidad de esta subunidad (región encuadrada). Se muestra la misma vista girada 90° (derecha). La densidad de micelas desordenadas se muestra como gris translúcido. ( e ) Variabilidad de la posición de SGBPlev en los utilisomas unidos al sustrato con FOS corto (~ DP8-12) y un GHlev activo, y FOS largo (DP15-25) con un GHlev inactivo. Un estado novedoso se observa únicamente en la estructura larga de FOS con un SGBPlev (naranja) extendiéndose y contactando el SGBPlev asociado con la otra subunidad SusC que está presente en un estado acoplado. Esta conformación es consistente con ambas subunidades SGBPlev en el utilisoma interactuando con la misma cadena de sustrato.

a, Disposición de GHlev y SGBPlev en SusC en el utilisoma de leván. GHlev hace contacto con el bucle extracelular 1 (dorado) y el bucle extracelular 9 (rojo), mientras que SGBPlev solo hace contacto con el bucle extracelular 1. b, Disposición de GHdex y SGBPdex en SusC en el utilisoma de dextrano. Aquí, el bucle extracelular 1 de SusCdex es el sitio principal de interacción para GHdex, mientras que el bucle extracelular 9 comprende la interfaz con SGBPdex. Para mayor claridad, se muestra la mitad del utilisoma en cada caso y se omiten los componentes de SusD. Tenga en cuenta que el modelo de utilisoma de dextrano es un compuesto de estructuras crio-EM (SusCdex) y modelos predichos de AlphaFold2 (GHdex y SGBPdex).

Vista lateral (a) y superior (b) del mapa de utilisomas de dextrano heptamérico. Se muestran las vistas lateral (c) y superior (d) idénticas de un modelo atómico compuesto para el utilisoma de dextrano. Los datos de CryoEM permitieron refinar SusCdex. Las predicciones de la estructura AlphaFold2 para SusDdex y GHdex se acoplaron al mapa cryoEM para el complejo heptamérico. Una predicción de estructura AlphaFold2 para parte de SGBPdex también se ajustó al mapa cryoEM. La densidad inequívoca fue visible solo para los dos primeros dominios de SGBPdex, y el modelo predicho se truncó antes del dominio C-terminal. SusCdex = púrpura, SusDdex = rosa, GHdex = cian y SGBPdex = verde. El refinamiento del complejo heptamérico tenía una resolución global de 3,1 Å. (e) Salidas refinadas de clasificación 3D vistas donde cada mapa corresponde a un complemento único o disposición de componentes auxiliares (como se etiqueta). ( f ) Esquema de la arquitectura de dos utilisomas de apo glicanos. El utilisoma de leván (izquierda) está coloreado como en el texto principal (SusClev = verde, SusDlev = gris, GHlev = azul y SGBPlev = magenta). El esquema equivalente para el utilisoma de dextrano sin sustrato está a la derecha. Tenga en cuenta la diferente disposición de los componentes GH y SGBP en relación con SusD en los sistemas de leván y dextrano.

(a) Densidad de FOS aislada obtenida del conjunto de datos de utilisomas de leván con GHlev activo y FOS corto (DP8-12)12. La densidad del sustrato (amarillo) se muestra en los umbrales alto (izquierda) y bajo (derecha). ( b ) Densidad de FOS aislada obtenida de la estructura utilisómica con GHlev inactivo y FOS largo (DP15-25). La densidad de Levan (naranja) se muestra en los umbrales alto (izquierda) y bajo (derecha). Las flechas indican ramas de fructosa que faltan en relación con (a). En el sitio FOS1, falta la densidad para la supuesta decoración β2,1 en Frc4. Por el contrario, la densidad contigua se extiende más allá de la densidad previamente resuelta en FOS2, con una nueva decoración β2,1 en Frc5. El sustrato unido en el sitio FOS2 sigue una tendencia similar con la cadena lateral de fructosa unida a β2,1 modelada previamente que es mucho más débil con FOS más largos, mientras que la densidad adicional atribuida a otro monómero unido a β2,6 extiende la cadena hacia el sitio FOS1. En niveles de umbral más altos, la densidad conecta los sitios de unión de FOS1 y FOS2, lo que indica que FOS más largos (~DP15) pueden ocupar ambos sitios simultáneamente. La densidad de conexión es débil e indicativa de múltiples conformaciones, consistente con la ausencia de contactos de SusClev a este segmento. Estos datos confirman que el transportador tiene una considerable promiscuidad de unión al sustrato y que, como se sugirió anteriormente, se puede acomodar un FOS relativamente largo (~15 DP)12. Los modelos de FOS que se muestran son de la estructura cristalina de rayos X original del complejo SusCDlev determinado en presencia de FOS corto (DP6-12)12. ( c ) Estructura Cryo-EM del GHlev inactivo con FOS unido (azul) superpuesto con las dos estructuras cristalinas (7ZNR y 7ZNS; naranja, gris). ( d, e ) Comparación de FOS unido en los sitios de unión FOS3 (el sitio activo) y FOS4 (secundario) de GHlev. Las puntas de flecha apuntan a rupturas en la cadena de FOS en las estructuras cristalinas, posiblemente como resultado del uso de un DP FOS más bajo para la cocristalización que para la crio-EM. Las vistas en (d) y (e) se generan a partir de una superposición.

( a ) La titulación de FOS de longitud definida 1 mM en SGBPlev de tipo salvaje 50 μM sugiere que se requieren ~ 15 unidades de fructosa para una afinidad total, que se elimina por la mutación WAWA (W297A/W359A). (b) Las titulaciones ITC de 8 mg/ml de leván, inulina o dextrano 500 en SGBPlev 50 μM muestran su especificidad para el leván. ( c ) Datos de ITC de valoraciones de variantes de GHlev (todos los residuos indicados mutaron a alanina en el fondo de D42A GHlev inactivo). Se valoró Levan (8 mg/ml) en 50 µM de la variante de GHlev indicada. Los supuestos de ajuste de datos se describen en los métodos. ( d ) Representación de superficie del modelo GHlev, con FOS mostrado como barras amarillas. En el recuadro hay vistas ampliadas de los sitios de unión de FOS3 (sitio activo) y FOS4 (secundario), en los que se muestran modelos atómicos en representación de dibujos animados para FOS3 con cadenas laterales para residuos aromáticos (Y70A, W318A). Para el sitio de unión secundario, estos residuos son W217A, F243A, Y437A.

Datos fuente

a, Descripción general y b, Vista de cerca del sitio de enlace SGBPlev FOS. Los residuos aromáticos y polares que probablemente interactúen con el FOS se muestran como modelos de barras grises. La estructura crio-EM de SGBPlev se alineó con los modelos predichos homólogos AlphaFold2 seleccionados (c – f). c, Bacteroides sp. D2 SGBPlev (UniProt E5CCB3). d, Prevotella oralis ATCC 33269 SGBPlev (E7RM14). e, comuna de Flavobacterium SGBPlev (A0A1D9P8I4). f,f cellulosilyticum SGBPlev (A0A4R5CJN9). Los residuos de unión a FOS equivalentes a los de b se muestran como modelos de barras grises (si están presentes). La cadena FOS del modelo SGBPlev cryo-EM se muestra en b–f como referencia (naranja y rojo). La identidad indicada en cada panel corresponde solo a la secuencia del dominio de unión a leván C-terminal en comparación con SGBPlev de B. theta. Aunque no pudimos identificar con confianza qué residuos de SGBPlev forman enlaces de hidrógeno con FOS a partir de los mapas crio-EM, el análisis de conservación del sitio de unión indica que es probable que N295, T350, Q352 y N384 de SGBPlev estén involucrados en la unión de FOS. La alineación de la secuencia de aminoácidos de los modelos que se muestran aquí se puede encontrar en la Fig. 3 complementaria.

Este archivo contiene Discusión Complementaria, Figs. 1–4 y Referencias.

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Reimpresiones y permisos

White, JBR, Silale, A., Feasey, M. et al. Los utilisomas de la membrana externa median la absorción de glicanos en Bacteroidetes intestinales. Naturaleza (2023). https://doi.org/10.1038/s41586-023-06146-w

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Recibido: 08 julio 2022

Aceptado: 27 de abril de 2023

Publicado: 07 junio 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41586-023-06146-w

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